Protein är en viktig komponent i alla organismer. Var och en av dess molekyler består av en eller flera polypeptidkedjor som består av aminosyror. Även om den information som är nödvändig för liv är kodad i DNA eller RNA, utför rekombinanta proteiner ett brett spektrum av biologiska funktioner i organismer, inklusive enzymatisk katalys, skydd, stöd, rörelse och reglering. Beroende på deras funktioner i kroppen kan dessa ämnen delas in i olika kategorier, såsom antikroppar, enzymer, strukturell komponent. Med tanke på deras viktiga funktioner har sådana föreningar studerats intensivt och använts i stor utsträckning.
Tidigare var det huvudsakliga sättet att få ett rekombinant protein att isolera det från en naturlig källa, vilket vanligtvis är ineffektivt och tidskrävande. De senaste framstegen inom biologisk molekylär teknologi har gjort det möjligt att klona DNA som kodar för en specifik uppsättning ämnen till en expressionsvektor för ämnen som bakterier, jäst, insektsceller och däggdjursceller.
Enkelt uttryckt, rekombinanta proteiner översätts av exogena DNA-produkter tilllevande celler. Att få dem innebär vanligtvis två huvudsteg:
- Klonning av en molekyl.
- Protein expression.
För närvarande är tillverkningen av en sådan struktur en av de mest kraftfulla metoderna som används inom medicin och biologi. Kompositionen har en bred tillämpning inom forskning och bioteknik.
Medicinsk anvisning
Rekombinanta proteiner ger viktiga behandlingar för olika sjukdomar som diabetes, cancer, infektionssjukdomar, hemofili och anemi. Typiska formuleringar av sådana substanser inkluderar antikroppar, hormoner, interleukiner, enzymer och antikoagulanter. Det finns ett växande behov av rekombinanta formuleringar för terapeutisk användning. De låter dig utöka behandlingsmetoderna.
genetiskt framställda rekombinanta proteiner spelar en nyckelroll på marknaden för terapeutiska läkemedel. Däggdjursceller producerar för närvarande de mest terapeutiska medlen eftersom deras formuleringar är kapabla att producera naturliga ämnen av hög kvalitet. Dessutom produceras många godkända rekombinanta terapeutiska proteiner i E. coli på grund av god genetik, snabb tillväxt och hög produktivitet. Det har också en positiv effekt på utvecklingen av läkemedel baserade på detta ämne.
Forskning
Att erhålla rekombinanta proteiner bygger på olika metoder. Ämnen hjälper till att ta reda på kroppens grundläggande och grundläggande principer. Dessa molekyler kan användas för att identifiera och bestämmalokalisering av ämnet som kodas av en viss gen, och för att avslöja funktionen hos andra gener i olika cellulära aktiviteter såsom cellsignalering, metabolism, tillväxt, replikation och död, transkription, translation och modifiering av föreningarna som diskuteras i artikeln.
Den observerade sammansättningen används därför ofta inom molekylärbiologi, cellbiologi, biokemi, strukturella och biofysiska studier och många andra vetenskapsområden. Samtidigt är det en internationell praxis att erhålla rekombinanta proteiner.
Sådana föreningar är användbara verktyg för att förstå intercellulära interaktioner. De har visat sig effektiva i flera laboratoriemetoder som ELISA och immunhistokemi (IHC). Rekombinanta proteiner kan användas för att utveckla enzymanalyser. När de används i kombination med ett par lämpliga antikroppar kan celler användas som standarder för ny teknologi.
Bioteknik
Rekombinanta proteiner som innehåller en aminosyrasekvens används också inom industri, livsmedelsproduktion, jordbruk och bioteknik. Till exempel, inom djurhållning kan enzymer tillsättas maten för att öka foderingrediensernas näringsvärde, minska kostnader och avfall, stödja djurens tarmhälsa, förbättra produktiviteten och förbättra miljön.
Dessutom mjölksyrabakterier (LAB) under lång tidhar använts för att producera fermenterade livsmedel, och nyligen har LAB utvecklats för uttryck av rekombinanta proteiner som innehåller en aminosyrasekvens, som kan användas i stor utsträckning, till exempel för att förbättra matsmältningen hos människor, djur och näringsämnen.
Men dessa substanser har också begränsningar:
- I vissa fall är produktionen av rekombinanta proteiner komplex, kostsam och tidskrävande.
- Ämnen som produceras i celler kanske inte matchar naturliga former. Denna skillnad kan minska effektiviteten av terapeutiska rekombinanta proteiner och till och med orsaka biverkningar. Dessutom kan denna skillnad påverka resultaten av experiment.
- Det största problemet med alla rekombinanta läkemedel är immunogenicitet. Alla biotekniska produkter kan uppvisa någon form av immunogenicitet. Det är svårt att förutsäga säkerheten för nya terapeutiska proteiner.
I allmänhet har framstegen inom bioteknik ökat och underlättat produktionen av rekombinanta proteiner för en mängd olika tillämpningar. Även om de fortfarande har vissa nackdelar är ämnena viktiga inom medicin, forskning och bioteknik.
Sjukdomslänk
rekombinant protein är inte skadligt för människor. Det är bara en integrerad del av den övergripande molekylen i utvecklingen av ett visst läkemedel eller näringselement. Många medicinska studier har visat att påtvingat uttryck av proteinet FGFBP3 (förkortat BP3) i en laboratoriestam av överviktiga möss visade en signifikant minskning av deras kroppsfett.massa, trots den genetiska benägenheten att använda.
Resultaten av dessa prövningar visar att FGFBP3-proteinet kan erbjuda en ny behandling för störningar associerade med metabolt syndrom som typ 2-diabetes och fettleversjukdom. Men eftersom BP3 är ett naturligt protein och inte ett konstgjort läkemedel, kan kliniska prövningar av rekombinant humant BP3 påbörjas efter den sista omgången av prekliniska studier. På, det vill säga, det finns skäl relaterade till säkerheten för att genomföra sådana studier. Det rekombinanta proteinet är inte skadligt för människor på grund av dess stegvisa bearbetning och rening. Förändringar sker också på molekylär nivå.
PD-L2, en av nyckelaktörerna inom immunterapi, nominerades till 2018 års Nobelpris i fysiologi eller medicin. Detta arbete, startat av prof. James P. Allison från USA och prof. Tasuku Honjo från Japan, har lett till behandling av cancerformer som melanom, lungcancer och andra baserat på checkpoint-immunterapi. AMSBIO har nyligen lagt till en stor ny produkt till sin immunterapilinje, PD-L2/TCR-aktivatorn - CHO Recombinant Cell Line.
I proof-of-concept-experiment har forskare vid University of Alabama i Birmingham, ledd av H. Long Zheng, MD, professor Robert B. Adams, och chef för Laboratory Medicine, Department of Pathology, UAB School of Medicin, har lyft fram en potentiell terapi, en sällsynt men dödlig blödningsstörning, TTP.
Resultaten av dettastudier visar för första gången att transfusion av rADAMTS13-laddade trombocyter kan vara en ny och potentiellt effektiv terapeutisk metod för arteriell trombos associerad med medfödd och immunmedierad TTP.
Rekombinant protein är inte bara ett näringsämne, utan också ett läkemedel i sammansättningen av läkemedlet som utvecklas. Dessa är bara några områden som nu är involverade i medicin och relaterade till studiet av alla dess strukturella element. Som internationell praxis visar gör ett ämnes struktur det möjligt på molekylär nivå att hantera många allvarliga problem i människokroppen.
Vaccinutveckling
Ett rekombinant protein är en specifik uppsättning molekyler som kan modelleras. En liknande egenskap används vid utveckling av vacciner. En ny vaccinationsstrategi, även känd som användningen av en speciell rekombinant virusinjektion, kan skydda miljontals kycklingar i riskzonen från en allvarlig luftvägssjukdom, sa forskare från University of Edinburgh och Pirbright Institute. Dessa vacciner använder ofarliga eller svaga versioner av ett virus eller en bakterie för att föra in bakterier i kroppens celler. I det här fallet använde experter rekombinanta virus med olika spikproteiner som vaccin för att skapa två versioner av ett ofarligt virus. Det finns många olika droger byggda kring denna koppling.
Rekombinanta proteinhandelsnamn och analoger är följande:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Dessa är huvudsakligen läkemedel mot cancer, men det finns andra behandlingsområden förknippade med denna aktiva substans.
Ett nytt vaccin, även kallat LASSARAB, designat för att skydda människor mot både lassafeber och rabies, har visat lovande resultat i prekliniska studier, enligt en ny studie publicerad i den vetenskapliga tidskriften Nature Communications. En inaktiverad rekombinant vaccinkandidat använder ett försvagat rabiesvirus.
Forskargruppen infogade genetiskt material från Lassa-virus i en rabiesvirusvektor så att vaccinet skulle uttrycka ytproteiner i både Lassa- och rabiesceller. Dessa ytföreningar framkallar ett immunsvar mot smittämnen. Detta vaccin inaktiverades sedan för att "förstöra" det levande rabiesvirus som användes för att göra bäraren.
Hämta metoder
Det finns flera system för att framställa ett ämne. Den allmänna metoden för att erhålla ett rekombinant protein är baserad på att erhålla biologiskt material från syntesen. Men det finns andra sätt.
För närvarande finns det fem huvudsakliga uttryckssystem:
- E. coli uttryckssystem.
- Yeast expression system.
- Upptryckssystem för insektsceller.
- Expressionssystem för däggdjursceller.
- Cellfritt proteinuttryckssystem.
Det senare alternativet är särskilt lämpligt för uttryck av transmembranproteineroch giftiga föreningar. På senare år har substanser som är svåra att uttrycka med konventionella intracellulära metoder framgångsrikt integrerats i celler in vitro. I Vitryssland är produktionen av rekombinanta proteiner i stor utsträckning. Det finns ett antal statligt ägda företag som hanterar denna fråga.
Cell Free Protein Synthesis System är en snabb och effektiv metod för att syntetisera målämnen genom att lägga till olika substrat och energiföreningar som är nödvändiga för transkription och translation i det enzymatiska systemet av cellulära extrakt. Under de senaste åren har fördelarna med cellfria metoder för typer av substanser som komplexa, giftiga membran gradvis dykt upp, vilket visar deras potentiella tillämpning inom det biofarmaceutiska området.
Cellfri teknologi kan lägga till en mängd olika icke-naturligt förekommande aminosyror enkelt och på ett kontrollerat sätt för att uppnå komplexa modifieringsprocesser som är svåra att lösa efter konventionellt rekombinant uttryck. Sådana metoder har högt tillämpningsvärde och potential för läkemedelsleverans och vaccinutveckling med användning av virusliknande partiklar. Ett stort antal membranproteiner har framgångsrikt uttryckts i fria celler.
Uttryck för kompositioner
Rekombinant protein CFP10-ESAT 6 produceras och används för att skapa vacciner. Ett sådant tuberkulosallergen gör att du kan stärka immunförsvaret och utveckla antikroppar. I allmänhet involverar molekylära studier studiet av alla aspekter av ett protein, såsom struktur, funktion, modifieringar, lokalisering eller interaktioner. Att utforskahur specifika ämnen reglerar interna processer kräver forskare vanligtvis medel för att producera funktionella föreningar av intresse och nytta.
Med tanke på storleken och komplexiteten hos proteiner är kemisk syntes inte ett hållbart alternativ för denna strävan. Istället används vanligtvis levande celler och deras cellulära maskineri som fabriker för att skapa och konstruera substanser baserade på de medföljande genetiska mallarna. Det rekombinanta proteinexpressionssystemet genererar sedan den nödvändiga strukturen för att skapa ett läkemedel. Därefter kommer valet av nödvändigt material för olika kategorier av droger.
Till skillnad från proteiner är DNA lätt att konstruera syntetiskt eller in vitro med hjälp av väletablerade rekombinanta tekniker. Därför kan DNA-mallar för specifika gener, med eller utan tillsatta reportersekvenser eller affinitetsmarkörsekvenser, utformas som mallar för uttryck av den övervakade substansen. Sådana föreningar härledda från sådana DNA-mallar kallas rekombinanta proteiner.
Traditionella strategier för uttryck av en substans involverar transfektering av celler med en DNA-vektor som innehåller en mall och sedan odling av cellerna för att transkribera och översätta det önskade proteinet. Typiskt lyseras sedan cellerna för att extrahera den uttryckta föreningen för efterföljande rening. Det rekombinanta proteinet CFP10-ESAT6 bearbetas på detta sätt och går igenom ett reningssystem från ev.bildandet av toxiner. Först efter det kommer det att syntetiseras till ett vaccin.
Både prokaryota och eukaryota in vivo-expressionssystem för molekylära substanser används i stor utsträckning. Valet av system beror på typen av protein, kravet på funktionell aktivitet och det önskade utbytet. Dessa uttryckssystem inkluderar däggdjur, insekter, jästsvampar, bakterier, alger och celler. Varje system har sina egna fördelar och utmaningar, och att välja rätt system för en viss applikation är viktigt för att det ämne som granskas ska kunna uttryckas framgångsrikt.
Uttryck från däggdjur
Användningen av rekombinanta proteiner möjliggör utveckling av vacciner och läkemedel på olika nivåer. För detta kan denna metod för att erhålla ett ämne användas. Däggdjursexpressionssystem kan användas för att producera proteiner från djurriket som har den mest naturliga strukturen och aktiviteten på grund av sin fysiologiskt relevanta miljö. Detta resulterar i höga nivåer av post-translationell bearbetning och funktionell aktivitet. Däggdjursexpressionssystem kan användas för att producera antikroppar, komplexa proteiner och föreningar för användning i cellbaserade funktionella analyser. Dessa fördelar är dock kombinerade med strängare kulturvillkor.
Däggdjursexpressionssystem kan användas för att generera proteiner övergående eller genom stabila cellinjer där expressionskonstruktionen integreras i värdgenomet. Medan sådana system kan användas i flera experiment, tidenproduktion kan generera en stor mängd substans på en till två veckor. Denna typ av rekombinant proteinbioteknik är efterfrågad.
Dessa övergående, högavkastande uttryckssystem för däggdjur använder suspensionskulturer och kan ge gram per liter. Dessutom har dessa proteiner mer naturlig veckning och posttranslationella modifieringar såsom glykosylering jämfört med andra expressionssystem.
Insektsuttryck
Metoder för att producera rekombinant protein är inte begränsade till däggdjur. Det finns också mer produktiva sätt när det gäller produktionskostnader, även om utbytet av ämnet per 1 liter behandlad vätska är mycket lägre.
Insektsceller kan användas för att uttrycka ett högnivåprotein med modifieringar som liknar däggdjurssystem. Det finns flera system som kan användas för att generera rekombinant baculovirus, som sedan kan användas för att extrahera ämnet av intresse i insektsceller.
Uttryck av rekombinanta proteiner kan lätt skalas upp och anpassas till suspensionskulturer med hög densitet för storskalig blandning av molekyler. De liknar mer funktionellt den naturliga sammansättningen av däggdjursmaterial. Även om utbytet kan vara upp till 500 mg/L, kan produktionen av rekombinant baculovirus vara tidskrävande och odlingsförhållandena är svårare än prokaryota system. Men i sydligare och varmare länder, en liknandemetoden anses vara mer effektiv.
Bakteriellt uttryck
Produktion av rekombinanta proteiner kan etableras med hjälp av bakterier. Denna teknik skiljer sig mycket från de som beskrivs ovan. Bakteriella proteinuttryckssystem är populära eftersom bakterierna är lätta att odla, växer snabbt och ger höga utbyten av den rekombinanta formuleringen. Emellertid är eukaryota ämnen i flera domäner som uttrycks i bakterier ofta icke-funktionella eftersom cellerna inte är utrustade för att utföra de nödvändiga posttranslationella modifieringarna eller molekylär vikning.
Dessutom blir många proteiner olösliga som inklusionsmolekyler, som är mycket svåra att återvinna utan hårda denaturatorer och efterföljande besvärliga molekylära återveckningsprocedurer. Denna metod anses för det mesta fortfarande till stor del vara experimentell.
Cell free expression
Rekombinant protein som innehåller aminosyrasekvensen för stafylokinas erhålls på ett något annorlunda sätt. Den ingår i många typer av injektioner och kräver flera system innan användning.
Cellfritt proteinuttryck är en in vitro-syntes av ett ämne med hjälp av translationellt kompatibla helcellsextrakt. I princip innehåller helcellsextrakt alla makromolekyler och komponenter som krävs för transkription, translation och till och med posttranslationell modifiering.
Dessa komponenter inkluderar RNA-polymeras, regulatoriska proteinfaktorer, transkriptionsformer, ribosomer och tRNA. När du lägger tillkofaktorer, nukleotider och en specifik genmall, kan dessa extrakt syntetisera proteiner av intresse på några timmar.
Även om de inte är hållbara för storskalig produktion, erbjuder cellfria eller in vitro proteinexpression (IVT) system ett antal fördelar jämfört med konventionella in vivo-system.
Cellfritt uttryck tillåter snabb syntes av rekombinanta formuleringar utan att involvera cellodling. Cellfria system gör det möjligt att märka proteiner med modifierade aminosyror, samt att uttrycka föreningar som genomgår snabb proteolytisk nedbrytning av intracellulära proteaser. Dessutom är det lättare att uttrycka många olika proteiner samtidigt med en cellfri metod (till exempel testa proteinmutationer genom småskaligt uttryck från många olika rekombinanta DNA-mallar). I detta representativa experiment användes IVT-systemet för att uttrycka det humana kaspas-3-proteinet.
Slutsatser och framtidsutsikter
Rekombinant proteinproduktion kan nu ses som en mogen disciplin. Detta är resultatet av många stegvisa förbättringar i rening och analys. För närvarande stoppas läkemedelsupptäcktsprogram sällan på grund av oförmågan att producera målproteinet. Parallella processer för uttryck, rening och analys av flera rekombinanta substanser är nu välkända i många laboratorier runt om i världen.
Proteinkomplex och växande framgång i tillverkningensolubiliserade membranstrukturer kommer att kräva fler förändringar för att hålla jämna steg med efterfrågan. Framväxten av effektiva kontraktsforskningsorganisationer för en mer regelbunden tillförsel av proteiner kommer att möjliggöra omfördelning av vetenskapliga resurser för att möta dessa nya utmaningar.
Dessutom bör parallella arbetsflöden möjliggöra skapandet av kompletta bibliotek av det övervakade ämnet för att möjliggöra ny målidentifiering och avancerad screening, tillsammans med traditionella läkemedelsupptäcktsprojekt för små molekyler.
