Gramfärgning används ofta inom mikrobiologi eftersom det är ett av de enklaste sätten att differentiera bakterier baserat på cellväggens sammansättning. Enligt Gram kan alla bakterier delas in i grampositiva (Gram (+)) och gramnegativa (Gram (-)). Gramfärgningsmetoden utvecklades 1884 och har inte förlorat i popularitet sedan dess, även om den har modifierats flera gånger.
Cellväggsstruktur
Gramfärgning avslöjar om en bakterie är Gram-positiv eller Gram-negativ. Uppdelningen av bakterier i Gram (+) och Gram (-) utförs i enlighet med strukturen på deras cellvägg.
Cellväggen innehåller den största mängden peptidoglykan (murein) - en komplex substans, som inkluderar peptapeptid och glykan. Glykanen består av alternerande rester av N-acetylglukosamin och N-acetylmuraminsyra kopplade till varandra med β-1,4-glykosidbindningar. Peptidoglykan ger cellform underhåll, osmotiskt skydd och antigena funktioner.
Huvudskillnaderna mellan grampositiva och gramnegativa bakterier
Olika bakterier har olika skikttjocklek på peptidoglykan. Hos bakterier som klassificeras som grampositiva varierar det från 15 till 80 nm, medan det hos gramnegativa är från 2 till 8 nm. Samtidigt har Gram-negativa bakterier en speciell struktur under peptidoglykanlagret, vilket Gram-positiva bakterier inte har - det periplasmatiska utrymmet. Detta utrymme är fyllt med hydrolytiska enzymer - β-laktamas, ribonukleas 1, fosfatas. Det är dessa enzymer som är ansvariga för gramnegativa bakteriers resistens mot många antibiotika.
Gram(-) peptidoglykanskiktet av bakterier är bundet till lipopolysackarid, en antigen struktur som innehåller endotoxin. I Gram(+)-bakterier har teichoinsyror liknande funktioner.
Gramnegativa bakterier har en extra struktur - det yttre membranet.
Käran i färgningsmetoden
Innan du börjar färga, förbereds utstryk av de studerade bakterierna. För att göra detta droppas vatten på en glasskiva och en kultur av mikroorganismer tillsätts där med en bakterieslinga. Sedan, efter att vattnet har torkat helt, fixeras smeten - glasskivan bärs flera gånger över brännarlågan. Gramfärgning är effektivare än färgning av levande bakterier - färgämnesmolekyler binder bättre till döda celler.
Färgning görs i flera steg:
- Små bitar av filterpapper läggs på ett fixerat utstryk och huvudfärgen hälls - gentiana violett eller metylenblått.
- Efter 3-5 minuter, ta bort det färgade filterpapperet och fyll utsmeten med Lugols lösning i 1 minut. I det här fallet mörknar beredningen.
- Lugollösningen dräneras och utstryket behandlas med ren etylalkohol: några droppar droppas på beredningen, dräneras efter 20 sekunder. Proceduren upprepas 2-3 gånger.
- Skölj testglaset med destillerat vatten.
- Producera ytterligare färgning - avsluta preparatet med fuchsin. Efter 1-2 minuter tvättas färgen bort.
- Efter att vattnet har torkat, undersök utstryket i mikroskop. Gram-positiva bakterier kommer att vara blåvioletta, gramnegativa bakterier kommer att vara rosa eller röda.
Orsaker till olika färgningsmönster
Som beskrivits ovan färgar Gram-färgning av bakterier grampositiva bakterier blåvioletta, medan gramnegativa bakterier färgas rött eller rosa. Anledningen till den differentiella färgningen av bakterier med denna metod är att efter att den lösliga formen av gentianaviol kommer in i cellen, övergår färgen till den olösliga jodformen. Under behandlingen av bakterier med etylalkohol extraheras lipider från membranet under verkan av detta opolära lösningsmedel. Membranet blir då poröst och är inte längre en betydande barriär mot färgläckage. dockpeptidoglykan är mer resistent mot opolära lösningsmedel, inklusive alkohol. Det är han som förhindrar uttvättningen av färgen, så bakterier med ett tjockt mureinskikt blir blåvioletta (grampositiva), och efter behandling med alkohol ändrar de inte färg.
Tunnt mureinlager av gramnegativa bakterier kan inte hålla färgämnesmolekylerna i cellen, så efter alkoholens inverkan blir de färglösa - färgar gramnegativa.
Efter exponering av ett utstryk för fuchsin förblir gramfärgade bakterier blåvioletta, medan gramnegativa bakterier blir rosa-röda.
Exempel på Gram(+)- och Gram(-)-bakterier
Gramnegativa bakterier inkluderar cyanobakterier, svavelbakterier, järnbakterier, klamydia, rickettsia, ättiksyrabakterier, många metylobakterier, tioniska bakterier, arsenitobakterier, karboxibakterier.
Bifidobakterier, många vattenlevande bakterier, streptokocker och stafylokocker är grampositiva.
