Absorption och ytterligare återemission av ljus av oorganiska och organiska medier är resultatet av fosforescens eller fluorescens. Skillnaden mellan fenomenen är längden på intervallet mellan ljusabsorption och emission av strömmen. Med fluorescens sker dessa processer nästan samtidigt, och med fosforescens, med viss fördröjning.
Historisk bakgrund
År 1852 beskrev den brittiska vetenskapsmannen Stokes för första gången fluorescens. Han myntade den nya termen som ett resultat av sina experiment med flusspat, som avgav rött ljus när det exponerades för ultraviolett ljus. Stokes noterade ett intressant fenomen. Han fann att våglängden för fluorescerande ljus alltid är längre än för excitationsljuset.
Många experiment utfördes på 1800-talet för att bekräfta hypotesen. De visade att en mängd olika prover fluorescerar när de utsätts för ultraviolett ljus. Material inkluderade bland annat kristaller, hartser, mineraler, klorofyll,medicinska råvaror, oorganiska föreningar, vitaminer, oljor. Den direkta användningen av färgämnen för biologisk analys började först 1930
Fluorescensmikroskopibeskrivning
Några av de material som användes i forskningen under första hälften av 1900-talet var mycket specifika. Tack vare indikatorer som inte kunde uppnås med kontrastmetoder har fluorescensmikroskopimetoden blivit ett viktigt verktyg inom både biomedicinsk och biologisk forskning. De erhållna resultaten var av ingen liten betydelse för materialvetenskap.
Vilka är fördelarna med fluorescensmikroskopi? Med hjälp av nya material blev det möjligt att isolera mycket specifika celler och submikroskopiska komponenter. Ett fluorescerande mikroskop låter dig upptäcka enskilda molekyler. En mängd olika färgämnen gör att du kan identifiera flera element samtidigt. Även om utrustningens rumsliga upplösning begränsas av diffraktionsgränsen, som i sin tur beror på provets specifika egenskaper, är det också fullt möjligt att detektera molekyler under denna nivå. Olika prover uppvisar autofluorescens efter bestrålning. Detta fenomen används ofta inom petrologi, botanik, halvledarindustrin.
Funktioner
Studien av djurvävnader eller patogena mikroorganismer kompliceras ofta av antingen för svag eller mycket stark ospecifik autofluorescens. Men värdet iforskning förvärvar introduktionen i materialet av komponenter som exciteras vid en specifik våglängd och som avger ett ljusflöde med den erforderliga intensiteten. Fluorokromer fungerar som färgämnen som kan självfästa på strukturer (osynliga eller synliga). Samtidigt kännetecknas de av hög selektivitet med avseende på mål och kvantutbyte.
Fluorescensmikroskopi har blivit flitigt använt med tillkomsten av naturliga och syntetiska färgämnen. De hade specifika emissions- och excitationsintensitetsprofiler och var inriktade på specifika biologiska mål.
Identifiering av enskilda molekyler
Ofta, under idealiska förhållanden, kan du registrera glöden från ett enda element. För att göra detta är det bland annat nödvändigt att säkerställa tillräckligt lågt detektorbrus och optisk bakgrund. En fluoresceinmolekyl kan avge upp till 300 000 fotoner innan de förstörs på grund av fotoblekning. Med en insamlingsgrad på 20 % och processeffektivitet kan de registreras till ett belopp av cirka 60 tusen
Fluorescensmikroskopi, baserad på lavinfotodioder eller elektronmultiplikation, gjorde det möjligt för forskare att observera beteendet hos enskilda molekyler i sekunder, och i vissa fall minuter.
Svårigheter
Nyckelproblemet är brusreducering från den optiska bakgrunden. På grund av det faktum att många av materialen som används vid konstruktionen av filter och linser uppvisar viss autofluorescens, var forskarnas ansträngningar i de inledande stadierna fokuserade på att utfärdakomponenter med låg fluorescens. Efterföljande experiment ledde dock till nya slutsatser. Speciellt har fluorescensmikroskopi baserad på total intern reflektion visat sig ge låg bakgrund och hög excitationsljuseffekt.
Mekanism
Principerna för fluorescensmikroskopi baserad på total intern reflektion är att använda en snabbt sönderfallande eller icke-utbredningsvåg. Det uppstår i gränssnittet mellan media med olika brytningsindex. I detta fall passerar ljusstrålen genom ett prisma. Den har ett högt brytningsindex.
Prismat ligger intill en vattenlösning eller glas med låg parameter. Om ljusstrålen riktas mot den i en vinkel som är större än den kritiska, reflekteras strålen helt från gränsytan. Detta fenomen ger i sin tur upphov till en icke-utbredningsvåg. Med andra ord genereras ett elektromagnetiskt fält som penetrerar ett medium med ett lägre brytningsindex på ett avstånd av mindre än 200 nanometer.
I en icke-utbredningsvåg kommer ljusintensiteten att vara ganska tillräcklig för att excitera fluoroforer. Men på grund av dess exceptionellt grunda djup kommer dess volym att vara mycket liten. Resultatet är en bakgrund på låg nivå.
Ändring
Fluorescensmikroskopi baserad på total intern reflektion kan realiseras med epi-belysning. Detta kräver linser med ökad numerisk bländare (minst 1,4, men det är önskvärt att den når 1,45-1,6), samt ett delvis upplyst fält av apparaten. Det senare uppnås med en liten fläck. För större enhetlighet används en tunn ring, genom vilken en del av flödet blockeras. För att erhålla en kritisk vinkel efter vilken total reflektion inträffar, behövs en hög brytningsnivå av nedsänkningsmediet i linserna och mikroskopets täckglas.