Odling av bakterier: metoder, principer, steg och villkor

2024 Författare: Angel Austin | [email protected]. Senast ändrad: 2023-12-17 05:42

Mikroorganismer i naturen omkring oss finns överallt: i jordar, vattendrag, på ytan av olika föremål, människor och djur bebos av dem. Allt detta kan fungera som källor till mikrobiell kontaminering av livsmedel, läkemedel och produktionslinjer. Odlingen av bakterier är nödvändig för att studera deras egenskaper, behov och egenskaper. Detta är i sin tur ett viktigt steg i utvecklingen av olika läkemedel, laboratoriediagnostik av sjukdomar, beräkning av produktionsreaktorer och mycket mer.

Allmänna begrepp

Odling av bakterier inom mikrobiologi avser odling av mikroorganismer som utförs i laboratoriet. I sin tur kallas mikrober som har vuxit på ett utv alt näringsmedium en kultur. Kulturer kan blandas om de bildas av olika typer av mikroorganismer, och rena om de representeras av endast en typ av bakterier.

Om det är näringsriktEndast en cell placeras i mediet, och en grupp individer erhålls som ett resultat av dess reproduktion, då kallas denna uppsättning mikroorganismer en klon. När en klon utvecklas till en punkt där den blir synlig för blotta ögat kallas denna samling av bakterier en koloni.

Vanligtvis utförs odling av bakterier isolerade från olika källor separat från varandra. Varje sådan separat odlad grupp av mikrober kallas en stam. Så om en typ av stafylokocker isoleras från tre källor (eller olika delar av samma produkt, olika personer), talar de om tre stammar av denna typ av stafylokocker.

Bakterietillväxtfaktorer

Dessa inkluderar olika aminosyror, lipider, purinbaser och andra föreningar som är nödvändiga för utvecklingen av mikroorganismer. Vissa mikrober kan självständigt producera de ämnen de behöver, medan andra behöver ta emot dem i färdig form. I enlighet med mikroorganismernas behov i vissa tillväxtfaktorer utförs identifiering och differentiering av bakterier. Denna parameter är också viktig för korrekt beredning av ett näringsmedium för laboratorie- och biotekniskt arbete:

• Aminosyror. Bakterier kan kräva en viss aminosyra eller grupp av syror. Så, klostridier behöver leucin och tyrosin, streptokocker behöver leucin och arginin. Mikroorganismer som kräver aminosyror utifrån för att växa kallas auxotrofer.
• Purin- och pyrimidinbaser, såväl som deras derivat (adenin, guanin och andra). De är en viktig faktor för mångas tillväxtStreptokockarter.
• Vitaminer. De är en del av de koenzymer som bakterier kräver. Så nikotinsyra, såväl som dess amid, som är en del av NAD och NADP, behövs av difteri och shigella corynebacteria. Tiamin, som en integrerad del av pyrofosfat, krävs av Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. Pantotensyra, som är en del av CoA-koenzymet, krävs av stelkrampsbaciller och vissa typer av streptokocker. Cytokromer, och därför folsyra, hem och biotin som bildar dem, är nödvändiga för Mycobacterium tuberculosis och Haemophilus influenzae.

Miljökrav

Villkor för odlingsmedier för odling av bakterier:

1. Näring. De måste dessutom innehålla ämnen i lättsmält form som är nödvändiga för att mikroorganismer ska kunna föda och fylla på energi. Dessa inkluderar organogener och mineraler. Vissa mikroorganismer kräver dessutom vitaminer och aminosyror som de inte kan syntetisera.
2. Optimal pH-nivå. Det påverkar cellmembranets permeabilitet och följaktligen förmågan att absorbera näringsämnen av bakterien. Oftast bör pH-värdet ligga på nivån 7, 2–7, 4. Många mikroorganismer producerar under sitt liv produkter med sura eller alkaliska reaktioner, och för att pH i näringsmediet inte ska förändras. den måste buffras.
3. Isotoniskt. Det osmotiska trycket i näringsmediet för odling av bakterier bör ha samma värden sominuti mikrobiella celler. Det motsvarar vanligtvis en 0,5 % NaCl-lösning.
4. Sterilitet. Detta beror på det faktum att uppkomsten av främmande bakterier kommer att förvränga resultaten av studien av den analyserade stammen.
5. Fuktighetsnivå. Denna indikator, tillsammans med mediets konsistens, bör ha optimala egenskaper för en viss typ av bakterier.
6. Redox-potential (RH2). Den visar förhållandet mellan ämnen som donerar och tar emot elektroner, samt nivån på syremättnad i näringsmediet. För aerober och anaerober skiljer sig förutsättningarna för att odla bakterier något i denna indikator. Anaeroba mikroorganismer reproducerar sig bäst vid RH2-värden under 5 och aeroba mikroorganismer vid minst 10.
7. Uniformitet. Det är viktigt att odlingsmediet innehåller konstanta mängder av dess individuella ingredienser. Dessutom är tydliga lösningar att föredra, som gör det lättare att övervaka grödans tillväxt eller upptäcka föroreningar.

Typer av kulturmedier

Valet av ett särskilt medium för att odla mikroorganismer påverkas av många faktorer, bland annat egenskaperna hos deras näring och syftet med studien. Huvuddragen bakom klassificeringen av näringsmedier är:

1. Komponenter. Beroende på de ursprungliga ämnen som används för att skapa substratet skiljer de åt:

• naturligt, som är framställt av produkter av animaliskt eller vegetabiliskt ursprung (t.ex. kött, mjölk, frukt) och är lämpliga att odla blandgrödor;
• halvsyntetisk, där dyra naturliga livsmedelsprodukter ersätts med icke-livsmedelsprodukter (till exempel benmjöl, blodproppar), och som är optimala för att odla vissa typer av bakterier eller isolera deras metaboliska produkter från miljö;
• syntet, som framställs av exakta mängder kemiska föreningar, har en känd konstant sammansättning och är lätta att reproducera.

2. Konsistens (densitet). Särskilj miljöer:

• liquid;
• dense;
• halvvätska.

De sista två är framställda av speciella lösningar eller flytande ämnen med tillsats av agar-agar eller gelatin för att skapa den nödvändiga densiteten. Dessutom är en tät miljö för tillväxt av bakterier koagulerat blodserum, potatis, silikagelmedia, karragenan.

3. Förening. På grundval av detta är miljöerna:

• enkel, listan över vilka är kort är Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), näringsgelatin och peptonvatten.
• komplex, framställd av enkla med tillsats av blod, vassle, kolhydrater och andra ämnen.

4. Utnämning. Följande näringsmedier särskiljs:

• main används för att odla många patogena mikrober (vanligtvis enkel sammansättning);
• speciella används för att isolera och odla bakterier som inte växer på enkla substrat;
• selektiva (de är också selektiva) är lämpliga för att isolera en specifik typ av bakterier och hämma tillväxten av associerade mikrober (selektivitetskapas genom att tillsätta vissa ämnen till mediet, såsom antibiotika eller s alter, eller genom att justera pH);
• differentialdiagnostik gör det möjligt att särskilja en typ av bakterier från en annan genom att bedöma exempelvis mediets enzymatiska aktivitet;
• konserveringsmedel behövs för initial ympning med efterföljande transport av prover, eftersom de förhindrar att mikroorganismer dör, samt hämmar tillväxten av andra bakterier.

Medieförberedelser

Det viktigaste steget i odlingen av anaeroba bakterier är beredningen av ett lämpligt näringsmedium. Efter att de optimala parametrarna har v alts, fortsätt till följande steg:

• vägning, genom att välja ett urval av komponenter på en analytisk våg;
• upplösning utförs i destillerat vatten uppvärmt till 70 °C, och fosfater, mikro- och makros alter löses separat;
• koka i vattenbad i två minuter;
• pH-bestämning med indikatorpapper eller potentiometer;
• filtrering genom våt tyg eller pappersfilter för flytande såväl som smälta täta medier, och genom ett bomullsgasfilter för agarmedia;
• tappning utförs med 3/4 kapacitet;
• medelberoende sterilisering;
• kontroll för sterilitet utförs genom att stanna i två dagar i en termostat, följt av visning;
• kemisk kontroll för att fastställa pH och innehåll av nödvändigaföremål;
• biologisk kontroll genom provympning.

Sterilisering av glasvaror och media

En av de grundläggande principerna för bakterieodling är sterilitet. Tillväxt och utveckling av främmande mikroorganismer kan påverka näringsmediets egenskaper genom att ändra dess kemiska sammansättning och pH. Sterilisering är huvudvillkoret för att odla renkulturer. I praktiken betyder denna term metoderna för förstörelse av absolut alla livsformer på ytan och i volymen av steriliserade föremål. Kärl, instrument som används, media och andra föremål som används under studien steriliseras.

Vissa typer av sterilisering:

• Tändning. Sterilisering av öglor och nålar för sådd, glasskiva, vissa instrument kan utföras med en brännare eller spritlampa.
• Kokning. Lämplig för hantering av sprutor, nålar, mat, men dödar inte bakteriesporer.
• Sterilisering med torr värme. Den utförs i ett speciellt torkskåp och är lämpligt för bearbetning av kolvar, provrör och andra laboratorieglasvaror.
• Ångsterilisering. Genomförd i en autoklav är denna metod mycket effektiv. Men det är inte lämpligt för näringsmedia som innehåller proteiner eller andra föreningar som bryts ner vid höga temperaturer. Mer sparsam kan kallas tyndalisering. Den utförs i Koch Boiler och kombinerar groningen av sporer med deras förstörelse.
• Pasteörisering. Det används för medier som ändrar sina egenskaper när de kokas (till exempel mjölk, vin, öl), kanbefria dem från icke-sporbärande mikroorganismer. Bearbetningstemperaturen är endast 50-60 ° C i femton till trettio minuter. I vissa fall används kallsterilisering, utförd med filter eller UV-strålar.

Bakterieodlingsförhållanden

Tillväxt och utveckling av bakterier är endast möjlig under vissa faktorer och värdena för var och en av dem:

1. Temperatur. Det finns tre grupper av bakterier som skiljer sig åt i temperaturpreferenser:

• termofiler, eller värmeälskande mikrober, växer vid 45-90°C, vilket betyder att de inte förökar sig i människor och djur;
• psykrofiler, eller kylälskande mikroorganismer, föredrar temperaturer i intervallet 5-15 °C och odlas i kylhus;
• mesofiler, utvecklas vid en temperatur på 25-37 °C, de inkluderar huvuddelen av bakterier.

2. Ljus. Det är ett inslag i odlingen av fototrofa bakterier, eftersom de utför fotosyntesprocessen. Men för de flesta mikrober är belysning ingen förutsättning. Och även vice versa kan ultraviolett ljus undertrycka deras utveckling.

3. Vatten. Alla mikroorganismer behöver vatten i tillgänglig (flytande) form. Det är därför fryst mat har liten eller ingen bakterietillväxt.

4. Miljöns surhet. Denna princip för att odla bakterier har redan diskuterats i detalj ovan.

5. Luftning. Syre, som ett kemiskt element, är en integrerad del av vatten och ett stort antal föreningar som används förodling av mikroorganismer. Gasformigt syre kan också finnas i vatten och andra vätskor i löst form. En betydande del av bakterierna behöver en konstant tillförsel av syremolekyler. Men för ett antal mikroorganismer är det onödigt, eller, ännu värre, gasformigt syre är giftigt för dem, eftersom de inte har katalas och peroxidas, som förstör giftiga andningsprodukter. Därför är det viktigaste steget i odlingen av anaeroba bakterier avlägsnandet av O₂ molekyler från näringsmediet.

6. Odling av mikroorganismer. Odlingen av aeroba och anaeroba bakterier utförs i olika lager av miljön och på olika sätt.

Odling av aeroba mikroorganismer

Odling av aeroba bakterier kräver molekylärt syre. För att erhålla rena kulturer av aerober som framgångsrikt kan användas inom medicin och livsmedelsindustrin, används följande metoder:

• yta som växer på täta medier eller i flytande media (deras tunna lager) när syre kommer direkt från luften;
• djupodling i flytande media, när en ökning av mängden syre löst i dem uppnås genom konstant luftning.

Odling av anaeroba mikroorganismer

Den grundläggande principen för att odla bakterier av denna typ är deras minimala kontakt med atmosfäriskt syre. Att ge förutsättningar för deras tillväxt är mycket svårare än för aerober. Följande metoder används för att isolera anaerober från molekylär O₂:

1. Fysisk. Denna metod för odling av anaeroba bakterier reduceras till deras odling i en speciell vakuumapparat - en mikroanaerostat. Luften i den ersätts av en speciell gasblandning av kväve med tillsats av 10 % väte och 5 % koldioxid.
2. Kemi. Dessa inkluderar: användning av absorberande medel (t.ex. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) eller reduktionsmedel (som askorbinsyra).
3. Biologisk. Det handlar om samodling av aerober och anaerober i ett slutet system. Denna metod för att odla bakterier innebär att ena halvan av en petriskål sås med några av de aeroba bakteriearterna och den andra halvan med den studerade anaeroba. Dess utveckling kommer att börja i det ögonblick då allt syre är förbrukat.

Följande såningsmetoder är lämpliga för att odla anaeroba bakterier:

• i ytskiktet;
• i ytskiktet fyllt med sterilt paraffin;
• i tjockt av ett tätt näringsmedium;
• i djupa lager av trögflytande media.

Få renkultur

Mikrobiologer arbetar vanligtvis med prover som bebos av många olika typer av mikrober. Men för att bestämma den systematiska positionen för mikroorganismer (familj, släkte, arter), samt för att studera deras egenskaper, är det nödvändigt att isolera dem och odla en ren kultur. De har stor betydelse i många livsmedelsindustrier, till exempel ost, bröd, kvass, vin etc. Odlingen av mjölksyrabakterier gör det möjligt att fåen viktig komponent för produktion av fermenterade mjölkprodukter, deg, kakao, ensilage och även plast.

Sättet att isolera en ren kultur i ett tätt medium är baserad på mekanisk separation av mikroorganismceller med efterföljande isolerad odling. Provet överförs till en steril volym vatten eller koks altlösning (volym 10-100 ml) och skakas sedan i två minuter. För att extrahera mikroorganismer som är belägna i tjockleken av materialet som studeras (till exempel korv eller ost) utförs först gnidning av provbitarna med sterila instrument med sand. Materialet som har genomgått preliminär beredning, som väger 1 g eller en volym av 1 ml, späds med sterilt vatten 10, 100, 1000, etc. gånger. Spädningsgraden väljs som ger en koncentration av celler som motsvarar metodens kapacitet.

Den efterföljande odlingen av mikroorganismer är att förbereda ett näringsmedium. Vanligtvis väljs ett tätt medium (MPA). Det smälts först och kyls ned till 45-50 °C, och först därefter hälls det i flera petriskålar (tre till fem stycken), på vars botten svabbar från testämnet med olika koncentrationer placeras. Därefter utförs blandning av det fortfarande inte frusna näringsmediet och materialet som införts i det. Så här fixeras celler vid olika punkter i substratets volym.

Nästa, petriskålar placeras i en termostat i 2 dagar vid 22 °C. Under denna tid förökar sig cellerna till en sådan grad att kolonin som bildas av var och en av cellerna blir synlig för blotta ögat. Var och en av dem är en ren kultur av den typ av bakterier från vars celler detros.

Därefter subodlas mikroorganismer från petriskålar till separata provrör fyllda med ett näringsmedium. På så sätt isoleras rena kulturer från ett blandat prov. Denna metod bär namnet på dess utvecklare - R. Koch. Det kallas också vanligen för koppmetoden, eller utarmande sådd. Efter att ha erhållit rena kulturer av olika typer av bakterier bestäms deras form, sporer och familjer.

Allt arbete måste utföras enligt principerna för asepsis. För att undvika för tidig utveckling av mikroorganismer bör undersökningen utföras omedelbart efter provtagning. Kranvatten analyseras efter att de första portionerna har tömts, eftersom de kan innehålla mikrober som samlats i rör och kranar. Mikrofloran av frukt, bär och grönsaker är huvudsakligen belägen på ytan (skal), därför utförs tvättningar från den. För att göra detta, placera fostret i en steril behållare och fyll den med den nödvändiga mängden vatten. Sedan skakas de ganska kraftigt och vattnet hälls i en annan behållare. Skördar från tygprodukter erhålls också i svabbar, men i förväg skärs bitar av en given storlek ut ur dem.