När man studerar ämnen i organisk kemi används mer än ett dussin olika kvalitativa reaktioner för att bestämma innehållet av vissa föreningar. En sådan visuell analys gör att du omedelbart kan förstå om de nödvändiga ämnena finns, och om de inte är närvarande kan du avsevärt minska ytterligare experiment för att identifiera dem. Dessa reaktioner inkluderar ninhydrin, som är den viktigaste i den visuella bestämningen av aminoföreningar.
Vad är det här?
Ninhydrin är en dikarbonylförening som innehåller en aromatisk ring med en heterocykel bunden till den, vars andra atom har 2 hydroxylgrupper (OH-). Detta ämne erhålls genom direkt oxidation av inandion - 1, 3 och har därför, enligt den internationella nomenklaturen, följande namn: 2, 2 - dihydroxiinandion -1, 3 (Fig. 1).
Rent ninhydrin är en gul eller vit kristallfärger som vid upphettning löser sig väl i vatten och andra polära organiska lösningsmedel, såsom aceton. Detta är ett ganska skadligt ämne, om det kommer i kontakt med huden i stora mängder eller slemhinnor, orsakar det irritation, även vid inandning. Arbeta med denna förening bör vara försiktig och endast med handskar, eftersom när den kommer i kontakt med huden, reagerar den med hudcellsproteiner och färgar den lila.
Reaktiva ämnen
Som nämnts ovan används ninhydrinreaktionen främst för visuell bestämning av innehållet av aminoföreningar:
- α-aminosyror (inklusive i proteiner);
- aminosocker;
- alkaloider som innehåller –NH2 och -NH-grupper;
- olika aminer.
Det bör noteras att sekundära och tertiära aminer ibland reagerar mycket svagt, så mer forskning behövs för att bekräfta deras närvaro.
Olika metoder för kromatografi används för kvantitativ bestämning, till exempel papperskromatografi (BC), tunnskiktskromatografi (TLC) eller med tvättning av fasta bärare med en lösning av ninhydrin i olika medier.
Denna reaktion är inte specifik för aminoföreningar, eftersom reagenset kan komma in i den på en gång. Men från reaktionsprodukternas sida har den en egenhet i form av frigörande av koldioxidbubblor (CO2), och detta är typiskt endast när det interagerar med α-amino syror.
Mekanismfunktioner
BDet finns olika tolkningar av ninhydrinreaktionsekvationen i litteraturen. Vissa forskare utelämnar bildningen av hydrindanthin från 2-aminoinandion, som, med deltagande av ammoniak och ninhydrin, också bildar ett färgämne som kallas "Rueman's purple" (eller "Rueman's blue"), medan andra, tvärtom, antar endast dess deltagande utan närvaro av mellanliggande aminoprodukter. Det finns också några intressanta punkter i registreringen av själva reaktionen, i synnerhet gäller detta metoderna för att fästa aminoderivatet av ninhydrin till dess huvudmolekyl för att bilda ett färgämne. Indikationen på platsen för det "vandrande väte" som erhålls av den intermediära aminen från det vattenh altiga mediet är också tveksam: det kan vara antingen i ketongruppen eller bredvid –NH2.
I verkligheten är nyansen med H-atomen obetydlig, eftersom dess position i föreningen inte spelar någon speciell roll under reaktionens gång, så den bör inte uppmärksammas. När det gäller utelämnandet av ett av de möjliga stadierna ligger orsaken här i den teoretiska aspekten: tills nu har den exakta mekanismen för bildandet av Ruemans lila inte bestämts exakt, så helt olika scheman för ninhydrinreaktionen kan hittas.
Det mest fullständiga möjliga förloppet för interaktion mellan reagenset och aminoföreningar kommer att föreslås nedan.
Reaktionsmekanism
För det första interagerar ninhydrin med α-aminosyra, fäster den vid platsen för klyvning av hydroxigrupper och bildar en kondensationsprodukt (Fig. 2a). Sedan förstörs den senare och frigör mellanprodukten amin, aldehyd och koldioxid (Fig. 2b). Från slutprodukten vid anslutningninhydrin, syntetiseras Rueman-lila strukturen (diketonhydrindenketohydrinamin, fig. 2c). Även indikerad är den möjliga bildningen av hydrindanthin (reducerad ninhydrin) från den intermediära aminen, som också förvandlas till en färgande förening i närvaro av ammoniak (närmare bestämt ammoniumhydroxid) med ett överskott av själva reagenset (fig. 2d).
Bildandet av hydrindantin bevisades av Rueman själv när vätesulfid verkar på ninhydrinmolekylen. Denna förening kan lösas i natriumkarbonat Na2CO3, vilket färgar lösningen mörkröd. Och när utspädd s altsyra tillsätts fälls hydrindantin ut.
Med största sannolikhet är den intermediära aminen, hydridanthin, ninhydrin och färgämnets struktur, på grund av deras instabilitet vid upphettning, i viss jämvikt, vilket tillåter närvaron av flera ytterligare steg.
Denna mekanism är lämplig för att förklara ninhydrinreaktionen med andra aminoföreningar, med undantag för biprodukter som härrör från eliminering av resten av strukturen från –NH2, -NH eller -N.
Biurettest och andra reaktioner på proteiner
Kvalitativ analys för peptidbindningar även av icke-proteinstrukturer kan ske inte bara med deltagande av ovanstående reagens. Men i fallet med en ninhydrinreaktion till proteiner sker interaktionen inte längs –CO-NH‒-grupper, utan längs amingrupper. Det finns en så kallad "biuretreaktion", som kännetecknas av tillsats av joner till lösningen med aminoföreningarbivalent koppar från CuSO4 eller Cu(OH)2 i ett alkaliskt medium (Fig. 3).
Under analysen, i närvaro av de nödvändiga strukturerna, blir lösningen mörkblå på grund av bindningen av peptidbindningar till ett färgkomplex, som skiljer ett reagens från ett annat. Det är därför biuret- och ninhydrinreaktionerna är universella i förhållande till protein- och icke-proteinstrukturer med –CO-NH‒-gruppen.
Vid bestämning av cykliska aminosyror används en xantoproteinreaktion med en koncentrerad lösning av salpetersyra HNO3 , vilket ger en gul färg vid nitrering. En droppe reagens på huden uppvisar också en gul färg genom att reagera med aminosyrorna i hudcellerna. Salpetersyra kan orsaka brännskador och bör även hanteras med handskar.
Exempel på interaktion med aminoföreningar
Ninhydrinreaktion för α-aminosyror ger ett bra visuellt resultat, förutom färgen prolin och hydroxiprolinstrukturer som reagerar med bildandet av en gul färg. En möjlig förklaring till denna effekt hittades i andra miljöförhållanden för interaktionen av ninhydrin med dessa strukturer.
Reaktion med aminogrupp
Eftersom testet inte är specifikt är visuell detektering av alanin med hjälp av ninhydrinreaktionen i blandningen inte möjlig. Genom papperskromatografi, när man applicerar prover av olika α-aminosyror, spraya dem med en vattenlösning av ninhydrin och framkalla i ett speciellt medium, kan man emellertidberäkna den kvantitativa sammansättningen av inte bara den påstådda föreningen utan även många andra.
Schematiskt följer interaktionen mellan alanin och ninhydrin samma princip. Det fäster till reagenset vid amingruppen och under inverkan av aktiva hydroniumjoner (H3O+) spjälkas det vid kolet -kvävebindning, sönderdelas till acetaldehyd (CH3COH) och koldioxid (CO2). En annan ninhydrinmolekyl fäster vid kväve, tränger undan vattenmolekyler, och en färgande struktur bildas (Fig. 4).
Reaktion med en heterocyklisk aminoförening
Ninhydrinreaktionen med prolin är specifik, särskilt vid kromatografiska analyser, eftersom sådana strukturer i ett surt medium först gulnar och sedan blir lila i ett neutr alt. Forskarna förklarar detta med ett särdrag av cykelomläggningen i den mellanliggande föreningen, som påverkas just av närvaron av ett stort antal väteprotoner som kompletterar den externa energinivån av kväve.
Förstörelsen av heterocykeln sker inte, och en annan ninhydrinmolekyl är fäst vid den vid den fjärde kolatomen. Vid ytterligare uppvärmning förvandlas den resulterande strukturen i ett neutr alt medium till Rueman-lila (Fig. 5).
Förberedelse av huvudreagenset
Ninhydrintest utförs med olika lösningar, beroende på upplösningen av aminostrukturer i vissa organiska ochoorganiska föreningar.
Huvudreagenset är beredningen av en 0,2 % lösning i vatten. Detta är en mångsidig blandning, eftersom de flesta föreningar löser sig väl i H2O. För att erhålla ett nyberedd reagens späds ett prov på 0,2 g kemiskt rent ninhydrin i 100 ml vatten.
Det är värt att notera att för vissa analyserade lösningar är denna koncentration otillräcklig, så 1 % eller 2 % lösningar kan beredas. Detta är typiskt för extrakt från medicinska råvaror, eftersom de innehåller olika klasser av aminoföreningar.
När man utför kromatografiska studier kan lösningar, till exempel när man tvättar en blandning på en fast bärare genom en kolonn, framställas i alkohol, dimetylsulfoxid, aceton och andra polära lösningsmedel - allt kommer att bero på lösningsmedlet för vissa aminostrukturer.
Application
Ninhydrinreaktionen gör det möjligt att detektera många aminoföreningar i lösning, vilket gjorde den till en av de första som användes i kvalitativ analys av organiska ämnen. Visuell bestämning minskar antalet experiment avsevärt, särskilt när man analyserar dåligt studerade växter, läkemedel och doseringsformer, såväl som okända lösningar och blandningar.
Inom krimin altekniken används denna metod i stor utsträckning för att fastställa förekomsten av svettmärken på vilken yta som helst.
Även trots reaktionens ospecificitet är det omöjligt att ta bort ninhydrinreaktionen från kemisk praxis, eftersomatt ersätta detta ämne med mindre toxiska analoger (till exempel oxolin) visade att de har sämre känslighet för aminogrupper och inte ger bra resultat i fotometriska analyser.
