Vad ligger bakom DNA-hybridisering? Även om den dubbelsträngade DNA-sekvensen i allmänhet är stabil under fysiologiska förhållanden, kommer förändringar av dessa förhållanden i laboratoriet (vanligtvis genom att höja omgivningstemperaturen) att göra att molekylerna separeras i individuella strängar. De senare är komplementära till varandra, men kan också komplettera andra sekvenser som finns i deras omgivning. Genom att sänka omgivningstemperaturen kan de enkelsträngade molekylerna härda eller "hybridisera" med varandra. Detta är DNA-hybridiseringsmetoden.
Konceptet ur molekylärbiologins synvinkel
Forskare involverade i både DNA-replikation och transkription av DNA till RNA förlitar sig på nukleotidkorsningar och molekylärbiologiska tekniker. Detta inkluderar Southern och Northern blöts, polymeraskedjereaktion (PCR) och de flesta DNA-RNA-hybridiserings- och sekvenseringsmetoder.
Application
Hybridisering är nukleotidens huvudsakliga egenskapsekvenser och används i många metoder inom molekylärbiologi. Det övergripande genetiska förhållandet mellan två arter kan bestämmas genom att hybridisera segment av deras DNA (DNA-DNA-hybridisering). På grund av sekvenslikheter mellan närbesläktade organismer krävs en högre temperatur för att smälta sådana DNA-hybrider jämfört med mer avlägsna organismer. Olika metoder använder hybridisering för att bestämma ursprunget för ett DNA-prov, inklusive polymeraskedjereaktionen (PCR). I en annan metod hybridiseras korta DNA-sekvenser till cellulärt mRNA för att identifiera uttryckta gener. Läkemedelsföretag undersöker användningen av antisens-RNA för att binda till oönskat mRNA, vilket förhindrar ribosomen från att översätta mRNA till protein.
DNA-DNA-hybridisering hänvisar i allmänhet till en molekylärbiologisk teknik som mäter graden av genetisk likhet mellan pooler av DNA-sekvenser. Det används vanligtvis för att bestämma det genetiska avståndet mellan två organismer. Det har använts i stor utsträckning inom fylogeni och taxonomi.
Methodology
DNA från en organism märktes och blandades sedan med omärkt DNA som kunde jämföras med det. Blandningen inkuberas för att tillåta DNA-strängarna att dissociera och kyls sedan för att bilda en regenererad hybrid dubbelsträngad DNA. Hybridiserade sekvenser med en hög grad av likhet kommer att binda tätare och kräva mer energi för att separera dem: d.v.s. de separeras när de värms upp till en högretemperatur än olika sekvenser, en process som kallas "DNA-smältning".
DNA smälter
Vi utvärderar smältprofilen för det hybridiserade DNA:t, det dubbelsträngade DNA:t binds till en så kallad "kolonn" och den resulterande blandningen upphettas. Vid varje steg tvättas kolonnen och DNA-sekvenserna som smälter blir enkelsträngade och tvättas bort från kolonnen. Temperaturerna vid vilka märkt DNA lämnar kolonnen återspeglar mängden likhet mellan sekvenser (och det självvikande mönstret fungerar som en kontroll). Dessa resultat kombineras för att bestämma graden av genetisk likhet mellan organismer. Enligt modern mikrobiologi är DNA-hybridisering omöjlig utan att förstå dessa saker.
När flera arter av ribonukleinsyra (eller deoxiribonukleinsyra) jämförs på detta sätt, tillåter likhetsvärdena att arterna kan placeras i det fylogenetiska trädet. Därför är detta ett av de möjliga tillvägagångssätten för att bedriva molekylär systematik. Charles Sibley och John Ahlquist, pionjärerna inom denna teknik, använde DNA-DNA-hybridisering för att studera de fylogenetiska förhållandena mellan fåglar (Sibley-Ahlquist-taxonomi) och primater.
Betydning för biologi
DNA-DNA-hybridisering är guldstandarden för att särskilja bakteriearter, med ett likhetsvärde på mer än 70 %, vilket indikerar att de jämförda stammarna tillhör olika arter. 2014 föreslogs ett tröskelvärde på 79 % likhet för att separera en bakteriell underart.
Kritiker hävdar att tekniken är felaktig för att jämföra närbesläktade arter, eftersom alla försök att mäta skillnader mellan ortologa sekvenser mellan organismer överväldigas av hybridiseringen av paraloga motsvarigheter i en organisms genom. DNA-sekvensering och beräkningssekvensjämförelser är för närvarande den vanligaste metoden för att bestämma genetiskt avstånd, även om detta tillvägagångssätt fortfarande används inom mikrobiologi för att hjälpa till att identifiera bakterier.
Det nuvarande sättet är att utföra DNA-DNA-hybridisering i silikon med hjälp av helt eller delvis sekvenserade genom. GGDC utvecklat av DSMZ är det mest exakta kända verktyget för att beräkna DDH-liknande värden. Bland andra algoritmiska förbättringar löser den problemet med paraloga sekvenser genom att noggrant filtrera bort dem från matchningar mellan två genomsekvenser.
FISH-metoden
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) är en laboratorieteknik som används för att detektera och sekvensera DNA, ofta på en specifik kromosom.
1969 publicerade Joseph Gall och Mary Lou Pardu en artikel som demonstrerade att radioaktiva kopior av en ribosomal DNA-sekvens kunde användas för att detektera komplementära DNA-sekvenser i kärnan i ett grodägg. Sedan dessa ursprungliga observationer har många förbättringar ökat mångsidigheten ochkänsligheten hos proceduren i sådan utsträckning att in situ hybridisering ("på plats", latin) nu anses vara ett viktigt verktyg inom cytogenetik. (Termen in situ används nu också för att hänvisa till det initiala stadiet av karcinomtillväxt, när endast epitelvävnad är involverad i den patologiska processen.)
Fluorescerande hybridiseringssekvens
RNA-sonder kan designas för vilken gen eller vilken sekvens som helst i en gen för att visualisera lncRNA och miRNA-mRNA i vävnader och celler. FISH används för att studera cellreproduktionscykeln, i synnerhet nukleär interfas för eventuella kromosomavvikelser. FISH låter dig analysera en stor serie av arkivfall, det är mycket lättare att identifiera den identifierade kromosomen genom att skapa en sond med en konstgjord kromosombas som kommer att attrahera liknande kromosomer.
Hybridiseringssignaler för varje sond när en nukleär abnormitet detekteras: varje mRNA- och lncRNA-detektionssond består av 20 par oligonukleotider, varje par täcker ett utrymme på 40-50 bp. s. Prober använder egen kemi för att detektera mRNA.
Hybridisering med DNA-sonder
Sonder görs ofta av DNA-fragment som har isolerats, renats och amplifierats för användning i utformningen av det mänskliga genomet. Storleken på det mänskliga genomet är så stort jämfört med längden som kan sekvenseras direkt att det är nödvändigt att dela upp det ifragment. I slutändan ordnades dessa fragment genom att smälta en kopia av varje fragment till ännu mindre enheter med sekvensspecifika endonukleaser för att mäta storleken på varje litet fragment med hjälp av storleksuteslutningskromatografi med hjälp av denna information för att bestämma var stora fragment överlappade varandra..
För att bevara elementen med deras individuella DNA-sekvenser, lades fragmenten till ett system av ständigt återkommande bakteriepopulationer. Klonala populationer av bakterier, där varje population upprätthåller en enda konstgjord kromosom, lagras i olika laboratorier runt om i världen. Artificiella kromosomer (BAC) kan odlas, extraheras och märkas i vilket laboratorium som helst som innehåller ett bibliotek. Genomiska bibliotek är ofta uppkallade efter de institutioner där de utvecklades. Ett exempel är RPCI-11-biblioteket, uppkallat efter Roswell Cancer Institute i Buffalo (New York, USA). Dessa fragment utgör cirka 100 tusen baspar och är grunden för de flesta FISH-sonder.
