Molekylärbiologiska forskningsmetoder spelar en stor roll inom modern medicin, krimin alteknik och biologi. Tack vare framsteg inom studiet av DNA och RNA kan en person studera en organisms genom, bestämma orsaken till en sjukdom, känna igen den önskade nukleinsyran i en blandning av syror, etc.
Molekylärbiologiska forskningsmetoder. Vad är det?
På 70- och 80-talen lyckades forskare för första gången dechiffrera det mänskliga genomet. Denna händelse gav impulser till utvecklingen av genteknik och molekylärbiologi. Studiet av egenskaperna hos DNA och RNA har lett till att det nu är möjligt att använda dessa nukleinsyror för att diagnostisera en sjukdom, studera gener.
Erhålla DNA och RNA
Molekylärbiologiska diagnostiska metoder kräver närvaro av utgångsmaterial: oftare är det nukleinsyror. Det finns flera sätt att isolera dessa ämnen från cellerna i levande organismer. Var och en av dem har sina egna fördelar och nackdelar, och det är nödvändigtta hänsyn till när du väljer en metod för att isolera rena nukleinsyror.
1. Skaffa DNA enligt Marmur. Metoden består i att en blandning av ämnen behandlas med alkohol, vilket leder till att rent DNA fälls ut. Nackdelen med denna metod är användningen av aggressiva ämnen: fenol och kloroform.
2. Isolering av DNA enligt Boom. Det huvudsakliga ämnet som används här är guanidintiocyanat (GuSCN). Det bidrar till utfällningen av deoxiribonukleinsyra på specialiserade substrat, från vilka den sedan kan samlas upp med hjälp av en speciell buffert. GuSCN är dock en hämmare av PTC, och även en liten del av det som kommer in i det utfällda DNA:t kan påverka förloppet av polymeraskedjereaktionen, som spelar en viktig roll i arbetet med nukleinsyror.
3. Sedimentering av föroreningar. Metoden skiljer sig från de tidigare genom att det inte är molekylerna av deoxiribonukleinsyra som fälls ut, utan föroreningar. För att göra detta används jonbytare. Nackdelen är att inte alla ämnen kan fällas ut.
4. Massscreening. Denna metod används i de fall där exakt information om DNA-molekylens sammansättning inte behövs, men det är nödvändigt att få fram vissa statistiska data. Detta förklaras av det faktum att nukleinsyrans struktur kan skadas när den behandlas med rengöringsmedel, särskilt alkalier.
Klassificering av forskningsmetoder
Alla molekylärbiologiska forskningsmetoder är indelade i tre stora grupper:
1. Amplifiering (med många enzymer). Härsyftar på PCR - polymeraskedjereaktion, som spelar en stor roll i många av de diagnostiska metoderna.
2. Icke-förstärkande. Denna grupp av metoder är direkt relaterad till driften av blandningar av nukleinsyror. Exempel är 3 blöts, in situ hybridisering, etc.
3. Metoder baserade på igenkänning av en signal från en sondmolekyl som binder till ett specifikt sond-DNA eller RNA. Ett exempel är Hybride Capture System (hc2).
Enzymer som kan användas i molekylärbiologiska forskningsmetoder
Många molekylära diagnostiska metoder involverar användningen av ett brett spektrum av enzymer. Nedan är de mest använda:
1. Restriktionsenzym - "klipper" DNA-molekylen i de nödvändiga delarna.
2. DNA-polymeras - syntetiserar en dubbelsträngad molekyl av deoxiribonukleinsyra.
3. Omvänt transkriptas (revertas) - används för att syntetisera DNA på en RNA-mall.
4. DNA-ligas - ansvarig för bildandet av fosfodiesterbindningar mellan nukleotider.
5. Exonukleas - tar bort nukleotider från de terminala sektionerna av deoxiribonukleinsyramolekylen.
PCR är huvudmetoden för DNA-amplifiering
Polymerase chain reaction (PCR) används aktivt inom modern molekylärbiologi. Detta är en metod där ett stort antal kopior kan erhållas från en enda DNA-molekyl (molekyler amplifieras).
Huvudfunktioner för PCR:
- diagnostiksjukdomar;
- kloning av DNA-segment, gener.
Följande element krävs för att utföra en polymeraskedjereaktion: den initiala DNA-molekylen, ett termostabilt DNA-polymeras (Taq eller Pfu), deoxiribonukleotidfosfater (källor till kväveh altiga baser), primers (2 primers per 1 DNA-molekyl) och själva buffertsystemet, där alla reaktioner är möjliga.
PCR består av tre steg: denaturering, primer-annealing och förlängning.
1. Denaturering. Vid en temperatur på 94-95 grader Celsius bryts vätebindningarna mellan de två DNA-strängarna, och som ett resultat får vi två enkelsträngade molekyler.
2. Primerglödgning. Vid en temperatur på 50-60 grader Celsius fästs primrar till ändarna av enkelsträngade nukleinsyramolekyler genom typen av komplementaritet.
3. Förlängning. Vid en temperatur på 72 grader sker syntesen av dotterdubbelsträngade molekyler av deoxiribonukleinsyra.
DNA-sekvensering
Molekylärbiologiska forskningsmetoder kräver ofta kunskap om nukleotidsekvensen i en deoxiribonukleinsyramolekyl. Sekvensering utförs för att bestämma den genetiska koden. Framtidens molekylär diagnostik kommer att baseras på kunskap från mänsklig sekvensering.
Följande typer av sekvensering urskiljs:
- Maxam-Gilbert-sekvensering;
- Sanger-sekvensering;
- pyrosequencing;
- nanoporesekvensering.
